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八十年代以來(lái)由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其嚴(yán)重的危害性而受到人們高度重視，力爭(zhēng)早期診斷和尋求有效治療是防止其廣泛傳播的關(guān)鍵所在.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)具有敏感、特異和快速的特點(diǎn)，是檢測(cè)病毒、評(píng)價(jià)病情進(jìn)展和探討發(fā)病機(jī)理的有效工具. 一、HIV的基因結(jié)構(gòu) HIV的基因結(jié)構(gòu)與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同，為RNA雙分子，其單鏈RNA分子由9749個(gè)核苷酸組成，有3組共9個(gè)基因。第一組為逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的基因，即gag、pol和env基因，及側(cè)翼的長(zhǎng)末端重復(fù)順序(LTR)等.其中前三者為病毒的結(jié)構(gòu)基因，編碼病毒蛋白，而基因組兩端的LTRs，不編碼任何蛋白，可起始其它病毒基因的表達(dá)，無(wú)種屬特異性.第二組為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的基因，即tat、rev和nef基因，可以增強(qiáng)或抑制其它基因的表達(dá).第三組為特有基因，負(fù)調(diào)控病毒的感染性，成熟或釋放，即vif、vpu和vpr.HIV有十分高的遺傳變異率，它是一個(gè)多態(tài)性病毒，從不同的AIDS患者體內(nèi)分離出的病毒結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一定的差異，事實(shí)上，獨(dú)立分離到的HIV-1和2彼此都不相同，這是由于病毒傳播過(guò)程中突變，缺失或插入引起的，高度變異區(qū)在env基因內(nèi)，相當(dāng)于gp120的五個(gè)區(qū)段，gag和pol基因較少變異，因此，只有選擇病毒基因組中高度保守區(qū)域作為目的基因加以擴(kuò)增，才能有效地檢測(cè)所有HIV的變異性.目前已知HIV有兩個(gè)型，HIV-1是從歐洲和美洲分離毒株的總稱(chēng)，亞洲地區(qū)的流行株也基本上為HIV-1，HIV-2是從西非的妓女分離的毒株. 二、PCR在鑒定HIV感染中的意義 HIV?？梢饾摲腥?，但仍具有傳染性，整合的病毒基因組在每個(gè)細(xì)胞中僅以很低的DNA拷貝數(shù)存在，因此，需要建立一個(gè)敏感而又特異的HIV檢測(cè)方法.傳統(tǒng)的檢測(cè)途經(jīng)很多，包括外周血抗原測(cè)定，病毒分離和逆轉(zhuǎn)錄酶法等，但均費(fèi)時(shí)費(fèi)力，穩(wěn)定性也差.核酸雜交雖有一定的特異性，敏感性卻較低，利用原位雜交發(fā)現(xiàn)AIDS患者僅有104～105之一的細(xì)胞有含有HIV-1DNA，實(shí)際上遠(yuǎn)不至此.聚合酶鏈反應(yīng)被稱(chēng)為無(wú)細(xì)胞的分子克隆技術(shù)(cell-free molecular cloning)，自1987年即被用于AIDS的研究中.Ou利用針對(duì)HIV-1LTR，gag和env基因的三對(duì)引物對(duì)HIV血清學(xué)和病毒分離均陽(yáng)性與血清學(xué)陽(yáng)性，但病毒分離陰性的男性同性戀者進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)前病毒DNA序列的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)前者的陽(yáng)性率為100%，后者也可達(dá)60%，對(duì)照組則均為陰性，因此提出PCR可以作為病毒分離的替代方法.Imagawa將PCR與其他幾種傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，結(jié)果在分離出HIV-1前，具有血清陽(yáng)轉(zhuǎn)的4例男性中3例可用PCR檢測(cè)出外周血淋巴細(xì)胞中g(shù)ag基因的存在，這種陽(yáng)性反應(yīng)可發(fā)生在血清陽(yáng)轉(zhuǎn)前38～42個(gè)月，而在得出PCR陽(yáng)性結(jié)果前，無(wú)一例分離出病毒，因而認(rèn)為，對(duì)仍從事高危活動(dòng)(如吸毒、同性戀等)的血清陽(yáng)性個(gè)體，PCR能有效地發(fā)現(xiàn)HIV感染者的存在.此外，臨床上AIDS患者常出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，而在許多血清學(xué)陽(yáng)性個(gè)體的腦脊液(CSF)中卻未分離出HIV-1，因而難以確定病毒的侵襲范圍.利用PCR技術(shù)已經(jīng)證實(shí)了CSF中存在著前病毒DNA和游離病毒RNA序列，而且RNA量似乎比DNA更為豐富.至于CSF中病毒序列的存在是否與神經(jīng)系統(tǒng)的損害有關(guān)，目前仍存在不同意見(jiàn)，但至少無(wú)癥狀感染者CSF中HIV-1的存在對(duì)闡明與HIV-1相關(guān)的神經(jīng)損害具有重要意義. 研究表明，HIV感染的女性所生的嬰兒中有30～59%可在宮內(nèi)、分娩過(guò)程或產(chǎn)后哺乳期感染該病毒，但由于嬰兒體內(nèi)存在來(lái)自母體的抗體且可持續(xù)15個(gè)月左右，同時(shí)又缺乏檢測(cè)IgM型抗體的手段等原因，使得傳統(tǒng)方法在鑒定新生兒是否感染方面受到限制，及時(shí)地對(duì)新生兒作出診斷，對(duì)于其獲得早期治療具有積極的意義.PCR技術(shù)所需標(biāo)本量少，對(duì)新生兒、嬰兒的診斷尤為適用.Roger用PCR對(duì)血清陽(yáng)性母親所生的23例兒童從新生兒開(kāi)始進(jìn)行外周血前病毒DNA的跟蹤監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，在后來(lái)發(fā)展為AIDS的7例兒童中，有5例在新生兒期即存在病毒序列，而血P24抗原卻檢測(cè)不到;具有AIDS非特異表現(xiàn)者，也有4/14在新生兒期呈陽(yáng)性PCR反應(yīng);由這些母親所生的健康兒童和陰性對(duì)照組則均為陰性，說(shuō)明本方法的特異性和靈敏性極高.Soeiro進(jìn)一步用PCR法證實(shí)了宮內(nèi)感染的存在，采集了23例AIDS或血清陽(yáng)性母親的流產(chǎn)兒組織，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并作原位分子雜交比較，結(jié)果有7例用PCR檢測(cè)到HIV-1DNA，而原位雜交只有1/8流產(chǎn)兒組織呈陽(yáng)性反應(yīng). 由于HIV具有高度的變異性，使得AIDS的治療顯得頗為棘手，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)體外病毒分離株對(duì)AZT易感性降低.Richman利用一對(duì)寡核苷酸引物對(duì)接受AZT治療者的外周血進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的535bp的片段中含有與AZT耐藥性有關(guān)的4個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶基因突變位點(diǎn)，而且突變數(shù)目與耐藥程度成比例，因此，PCR能有效地監(jiān)測(cè)毒株的耐藥性.利用env基因的高度變異性，對(duì)該基因特異性擴(kuò)增后進(jìn)行病毒分型，對(duì)于監(jiān)測(cè)毒株的變異及分子流行病學(xué)的研究具有十分積極的意義;對(duì)分娩健康嬰兒的AIDS女患者HIV基因的擴(kuò)增及分析，也有利于探討母嬰垂直傳播的條件及毒株的特點(diǎn)，從而研制出有效的疫苗. 由此，我們可以看出，PCR技術(shù)在鑒定HIV感染方面具有重要的意義，它可檢出抗體出現(xiàn)前的感染者，篩選新個(gè)體，確定病毒類(lèi)型和耐藥毒株，區(qū)分兒童感染的時(shí)間，并可作為AIDS的預(yù)后指征. 三、HIV感染的定量PCR研究 目前檢測(cè)體內(nèi)HIV活性的方法有限，雖然循環(huán)血CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清P24抗原、新喋呤、β2-MG等曾用來(lái)指示HIV感染時(shí)病毒的水平，其敏感性和特異性均受限，定量培養(yǎng)又費(fèi)時(shí)昂貴.定量PCR是HIV感染中直接測(cè)定病毒本身的最佳途徑.早期首先采用有限稀釋法，即將所采取的HIV感染者標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋后分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以反應(yīng)陽(yáng)性的最大稀釋度 作為病毒水平，缺點(diǎn)是不能給出病毒的絕對(duì)拷貝數(shù).后有作者用含有已知量的HIV序列的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行系列PCR反應(yīng)，然后以擴(kuò)增產(chǎn)物量對(duì)初始模板量得出標(biāo)準(zhǔn)曲線;待測(cè)標(biāo)本用相同體系擴(kuò)增后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得所加標(biāo)本量，從而推算出樣品中HIV的感染水平.但在反應(yīng)過(guò)程中既使嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件和操作步驟，同一份標(biāo)本在不同的試管內(nèi)也存在著擴(kuò)增的差異，即所謂的“試管效應(yīng)”，因此，為了使PCR定量客觀標(biāo)準(zhǔn)化，又引入了內(nèi)參照來(lái)消除這種差異，如利用HLADQα基因與HIV感染標(biāo)本用各自的引物在同一管中擴(kuò)增，前者模板量已知，且作一系列梯度管，后者以一恒定的未知量參與反應(yīng)，后用前者擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算后者的初始模板水平，但缺點(diǎn)是這種內(nèi)參模板的擴(kuò)增效率與HIV的擴(kuò)增效率不同. 從理論上講，在PCR反應(yīng)中應(yīng)存在著這樣一種關(guān)系，即Y=S(1＋e)n，Y指擴(kuò)增后拷貝數(shù)，S是初始拷貝數(shù)，n代表循環(huán)次數(shù)，e指擴(kuò)增效率.由于PCR對(duì)反應(yīng)條件和初始模板量高度敏感，因此e值變異很大，可在0～1范圍內(nèi)波動(dòng)，近年來(lái)在克服上述各種方法缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上而建立起來(lái)的競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR(QC-PCR)對(duì)HIV感染的定量分析已顯示出廣泛前景.其基本原理是人工設(shè)計(jì)與待測(cè)靶序列基本相同但能夠區(qū)分的突變體(包括缺失、插入和限制性酶切位點(diǎn)突變)作為競(jìng)爭(zhēng)模板，并以不同比例與一定量的靶序列共同混合于同一反應(yīng)體系中，在相同引物介導(dǎo)下，兩種模板共同擴(kuò)增，當(dāng)某一管中兩種擴(kuò)增產(chǎn)物的量相等時(shí)，該管中的已知競(jìng)爭(zhēng)模板濃度即為靶序列的初始模板濃度.Piatak以HIV的高度保守區(qū)域gag基因作為靶序列，用含有HIV基因組的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物用PCR方法合成一內(nèi)部缺失80bp的gag片段，然后將此片段重組克隆后作為競(jìng)爭(zhēng)模板.與待測(cè)標(biāo)本共同擴(kuò)增后的產(chǎn)物由于分子量大小不同，可用瓊脂糖、聚丙酰胺凝膠電泳及密度掃描等計(jì)數(shù)結(jié)果，從而確定起始模板數(shù).該方法在目前而言是一種相對(duì)客觀而準(zhǔn)確的定量途經(jīng)，但其缺點(diǎn)是每測(cè)一份標(biāo)本需設(shè)系列管，比較麻煩，造價(jià)昂貴，試劑盒難于推廣. 最近美國(guó)AcuGen System研制了一種新的封閉式定量PCR系統(tǒng)，將生化、計(jì)算機(jī)和光電技術(shù)相結(jié)合，并采用專(zhuān)用試劑，從擴(kuò)增的DNA直接做定量數(shù)據(jù)的讀取和分析，免除了傳統(tǒng)的電泳，照相等步驟，也排除標(biāo)本污染的可能性.設(shè)備由三部分組成，定量讀數(shù)器，擴(kuò)增儀和計(jì)算機(jī).其定量模式是根據(jù)能量轉(zhuǎn)換原理設(shè)計(jì).在PCR擴(kuò)增到一定程度時(shí)，加入一信號(hào)試劑，即萬(wàn)能信號(hào)雙鏈體，它是由互補(bǔ)的寡核苷酸鏈組成，該寡核苷酸鏈分別由具有熒光能量轉(zhuǎn)換的供受者加尾修飾，連接在擴(kuò)增引物的5'端，這種連接穩(wěn)定了信號(hào)雙鏈體，并建立了熒光能量轉(zhuǎn)換反應(yīng)，因?yàn)榉€(wěn)定結(jié)合在一起的雙鏈體接受光后會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)換.當(dāng)以后的循環(huán)開(kāi)始后，新生鏈開(kāi)始產(chǎn)生，引起這種結(jié)合的引物雙鏈體變?yōu)閱捂湥邮芄獾哪芰ο陆?，發(fā)生能量轉(zhuǎn)換的全部瓦解.熒光信號(hào)隨著循環(huán)次數(shù)的減少而被測(cè)量出來(lái)，以計(jì)算特定擴(kuò)增片段的不斷累積量.目前國(guó)內(nèi)已有這種HIV檢測(cè)試劑盒出售，但由于設(shè)備及試劑均很昂貴，限制了它的廣泛應(yīng)用. 對(duì)體內(nèi)的病毒水平作準(zhǔn)確的定量分析，有助于對(duì)感染過(guò)程的各期作病因性分析，觀察藥物的療效，更好地指導(dǎo)治療.Bagnarelli用QC-PCR法檢測(cè)33例HIV感染者外周血標(biāo)本中病毒的拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果提示，病毒拷貝數(shù)與疾病進(jìn)展和CD4+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少之間存在著與高度相關(guān)性，在疾病的各個(gè)階段均存在著HIV-1結(jié)構(gòu)基因的特異性轉(zhuǎn)錄和復(fù)制.有趣的是，盡管隨著疾病的進(jìn)展，病毒血癥不斷加重，但AIDS患者的個(gè)別感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性?xún)H中等度地高于無(wú)癥狀感染者.此外，血漿中HIV-1基因組RNA定量，似乎是更為可靠和敏感的病毒活性的標(biāo)志.另有作者用定量PCR發(fā)現(xiàn)AIDS患者血漿中HIV-1數(shù)量明顯高于無(wú)癥狀血清陽(yáng)性者，在每8～14周口服ddT劑量≥6.4mg/Kg.天的患者，其血漿HIV-1顆粒數(shù)量明顯降低，提示循環(huán)中游離病毒量與HIV-1的感染性滴度、CD4<400/mm3、HIV相關(guān)癥狀的存在和藥物治療密切相關(guān)，也說(shuō)明PCR是監(jiān)測(cè)這些指標(biāo)的有效方法. 在HIV-1感染過(guò)程中，與免疫功能密切相關(guān)的細(xì)胞因子有無(wú)變化，是探討其免疫致病機(jī)理的重要一環(huán)，由于細(xì)胞因子在血清中水平很低，僅達(dá)Pg水平;血清半衰期短，約數(shù)分到數(shù)小時(shí)，而且分泌后很快與受體結(jié)合，使得臨床標(biāo)本的檢測(cè)成為困難.Fan利用PCR法分析了HIV-1感染者外周血細(xì)胞因子mRNA水平的變化，以β-actin作為內(nèi)參照，對(duì)各種細(xì)胞因子mRNA水平定量，可精確至10個(gè)拷貝的mRNA.結(jié)果表明，血清陽(yáng)性的男性同性戀者PBMC中IFN-γmRNA水平升高，而IL-2mRNA水平卻下降，隨著病情進(jìn)展，這種變化更為明顯;CD4和CD8細(xì)胞中這些細(xì)胞因子mRNA水平也不相同;所有細(xì)胞因子在HIV感染后期表達(dá)均下降. 四、PCR的相關(guān)問(wèn)題 1.模板的選擇和提取 艾滋病患者和HIV感染者的血液和各種體液中均含有一定量的病毒.目前作為診斷和研究的標(biāo)本多采用外周血，因?yàn)镠IV是一種嗜T細(xì)胞性病毒，其中模板量豐富且易保存，因此從PBMC較易得到HIVDNA，另外血漿中存在的游離病毒也可以作為提供模板的原料.HIV也常侵犯單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞和皮膚的郎格罕氏細(xì)胞，所以也可采取除血液外的腦脊液和表皮組織提取模板來(lái)擴(kuò)增，以探討其致病機(jī)理.由于艾滋病多由性傳播引起，因此唾液和精液也存在較低量的病毒顆粒，而且已用PCR發(fā)現(xiàn)雖然精液中存在HIV-1DNA，但精子細(xì)胞中卻缺如，用PCR對(duì)這兩種體液中病毒的檢出對(duì)疾病的預(yù)防有重要意義. 傳統(tǒng)PCR中模板的提取包括細(xì)胞裂解，酸氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀核酸等過(guò)程，步驟繁多.現(xiàn)在多數(shù)作者傾向采用粗制細(xì)胞裂解液或冰凍血液直接進(jìn)行擴(kuò)增.Albert將HIV感染者PMBC在含有SDS.tritonX-100和蛋白酶K的裂解液中處理后，直接將此混合物用于擴(kuò)增，證明其非常適合于PCR過(guò)程.濾紙干血斑標(biāo)本(DBS)的應(yīng)用使標(biāo)本采集更加簡(jiǎn)便，它采用指血，特別適合于圍產(chǎn)期篩查和高危人群的分子流行病學(xué)大面積調(diào)查.Cassol測(cè)定了在模擬現(xiàn)場(chǎng)條件下保存DBS標(biāo)本的穩(wěn)定性和反應(yīng)性，證實(shí)經(jīng)過(guò)凍融、于22℃下保存22周或37℃和60%濕度下孵育7天的這種標(biāo)本的DNA完整并適用于擴(kuò)增分析，且低HIV拷貝數(shù)的DBS于上述條件下保存，PCR反應(yīng)性也未降低.對(duì)AIDS患者和HIV感染者DBS標(biāo)本的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，均產(chǎn)生較強(qiáng)的PCR信號(hào). 2.選擇合適的引物，改良條件提高敏感性. 這一點(diǎn)在許多文獻(xiàn)中均已報(bào)道主要原則為:1.減少設(shè)計(jì)引物的序列與HIV相關(guān)病毒或人細(xì)胞DNA的同源性;2，選擇的引物要盡量處于HIV基因組的高度保守區(qū)，如gag、env、pol、tat基因中的某些核苷酸序列;3.盡量保證引物3'端的堿基與模板的匹配，引物內(nèi)無(wú)一級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)不能有互補(bǔ)序列.常用的引物及位置見(jiàn)表1. 其次，PCR反應(yīng)過(guò)程中多對(duì)引物的應(yīng)用漸趨增多，由于HIV的高度變異，單純一對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果已被認(rèn)為不夠確切，至少需要兩對(duì)引物擴(kuò)增才能鑒別陽(yáng)性反應(yīng)的存在.事實(shí)上，多對(duì)引物的應(yīng)用可明顯提高PCR的敏感性，Albert通過(guò)4對(duì)引物的應(yīng)用，使100%的HIV感染者得到陽(yáng)性擴(kuò)增.套式引物PCR也能明顯提高HIV感染檢測(cè)的敏感性，并被用于AIDS患者病毒水平的定量研究中.Bagasra為使HIV感染的定量分析更加準(zhǔn)確化，以細(xì)胞本身作為反應(yīng)管，采用原位PCR，擴(kuò)增完整細(xì)胞中的基因片段，發(fā)現(xiàn)外周血中感染的PBMC頻率為0.1-13.5%，明顯高于普通PCR;結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)，發(fā)現(xiàn)某些疾病進(jìn)展者其CD4細(xì)胞比例增高，其HIV感染的CD4細(xì)胞水平也較高. 3.結(jié)果的檢測(cè) 標(biāo)本中模板得到有效的擴(kuò)增后，必須客觀地檢測(cè)出來(lái)，一般多采用瓊脂糖凝膠電泳后目測(cè)觀察特異性擴(kuò)增條帶，必要時(shí)可采用聚丙酰胺凝膠電泳以提高分辨率.但有時(shí)這種方法達(dá)不到足夠的敏感性，Keller報(bào)道了一種改良的探針檢測(cè)法，引物與HIV-1gag基因互補(bǔ)，且5'端以生物素標(biāo)記，擴(kuò)增的產(chǎn)物既作為標(biāo)本又作為探針;再設(shè)計(jì)一種“捕獲”探針，其序列正好位于兩引物之間，但不與引物重疊，這樣避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn).生物素化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在微量滴定板中被捕獲，然后再與鏈霉親和素一過(guò)氧化物酶結(jié)合物和四甲基聯(lián)苯胺底物反應(yīng)，用比色法測(cè)定，這種方法靈敏性和特異性大大提高.在QC-PCR中，為精確算出病毒拷貝數(shù)，將dNTP中的一種用放射性核素標(biāo)記，經(jīng)過(guò)30～50個(gè)循環(huán)后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即具有放射性.回收電泳膠帶，分別測(cè)定二者的放射活性，根據(jù)不同濃度突變模板與標(biāo)本的混合和擴(kuò)增產(chǎn)物的放射性強(qiáng)度之間的關(guān)系，可以精確算出標(biāo)本中DNA拷貝數(shù).但由于使用同位素存在半衰期短，危險(xiǎn)等缺點(diǎn)，雖可精確定量，卻限制了PCR的實(shí)際應(yīng)用，現(xiàn)也采用PCR-EIA(酶免疫法)來(lái)對(duì)HIV感染水平定量，來(lái)克服使用同位素的缺點(diǎn).另外目前有些實(shí)驗(yàn)室中采用的電泳后EB染色凝膠的密度掃描也可借鑒. PCR檢測(cè)HIV中常用的引物和探針
總之，PCR術(shù)在HIV感染研究中的應(yīng)用已獲良好效果，在目前亞洲地區(qū)HIV感染增長(zhǎng)速率十分迅猛的情況下，開(kāi)展此項(xiàng)技術(shù)的研究對(duì)于我國(guó)艾滋病的防治有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義. |
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