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無血清培養(yǎng)基  網(wǎng)址鏈接http://www.njtrx.cn/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2014/0514/5157.html

無菌操作基本技術

1、實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

2、無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。

3、小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4、工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5、定期檢測下列項目：

5.1. CO₂ 鋼瓶之CO₂ 壓力。
5.2. CO₂培養(yǎng)箱之CO₂ 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。
5.3. 無菌操作臺內之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(wǎng)(300 小時/預濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。

6、水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

培養(yǎng)基

1、液體培養(yǎng)基貯存于4 ℃ 冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。

2、液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。

3、粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)：

3.1. 細胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，然后用CO₂氣體調整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。

3.2. 材料：

3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要)
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體

3.3. 步驟：

3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO₃ 粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一)溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO₂ 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO₂ 之NaHCO₃ 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌笕芤褐畃H 應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入CO₂氣體調整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4 ℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾) 。
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。

4. 配制培養(yǎng)基之生長測試

4.1. 材料：

4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

4.2. 步驟：

4.2.1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個well 接種1 ×102 活細胞，同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。
4.2.3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不佳，則丟棄之。

細胞傳代培養(yǎng)

1、細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細胞種類而異。

2、材料：

2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)

2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20 ℃，使用前放在37 ℃ 水槽回溫。

2.3. 新鮮培養(yǎng)基

2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶

3、 步驟：

3.1. 附著型胞(adherent cell)

3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。

3.1.2. 用D-PBS 洗滌細胞一至二次。

3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm², 2ml/75cm²)，37 oC 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。)

3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.2. 懸浮型細胞(suspension cell)

3.2.1. 吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。

3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.3. 融合瘤(hybridoma)

3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基 稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。

收到細胞的處理方式

細胞活化

1、收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存(置于–70℃，隔夜后，移到liq N₂)。

2、冷凍細胞解凍程序

2.1. 依據(jù)細胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例， 制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細胞均無法立即適應不同之基礎培養(yǎng)基或不同之血清種類， 若因實驗需要， 必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據(jù)細胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。

2.3. 將培養(yǎng)基置于37 ℃水槽中回溫， 回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內。取出冷凍管， 立即放入37 ℃ 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內。

2.4. 依據(jù)細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取10 ml 培養(yǎng)基加至T25 或T75 flask 中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內之培養(yǎng)基， 混合均勻，放入37 ℃，5 % CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5. 對絕大多數(shù)細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除， 待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數(shù)因對DMSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需 立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細胞均勻混合后， 轉移至培養(yǎng)瓶中， 再放入37 ℃， 5 % CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

收到T25 flask 細胞時， 處理方式為

1、由于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。

2、將原封之T25 flask 靜置于37 ℃， 5 % CO₂ 培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至37 ℃， 并讓運送過程中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內取出flask 內之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內，依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中，或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養(yǎng)。

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