| ? | ||||||||||||
|
||||||||||||
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
| 購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 www.njtrx.cn |
轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途。
細胞轉(zhuǎn)染
1. 轉(zhuǎn)染試劑的準備 ① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。 ② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩。 2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。 3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。 4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。 5. 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。 6. 到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。
4種轉(zhuǎn)染方法的比較：DEAE葡聚糖是最早應(yīng)用哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負電的核酸結(jié)合后接近細胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染成功地用用于瞬時表達的研究，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不是十分可靠。
其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進一步改性，且其合成工藝復雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當有效的“質(zhì)子海綿”體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設(shè)計更復雜的基因載體時，PEI經(jīng)常做為核心組成成分。 線型PEI與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。
lonza 無血清 培養(yǎng)基 網(wǎng)址鏈接http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2014/0514/5157.html
http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html
|
購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物
www.njtrx.cn |
|
